ISHpalette™ Short hairpin amplifier

• パラフィン切片・凍結切片・浮遊切片・接着／浮遊細胞・ホールマウント全てに適用可能
• Proteinase K等のタンパク質分解酵素処理を必要としない
• SaraFluor™488, ATTO550, ATTO647Nの蛍光色素３色に対応

in situ Hybridization chain reaction (HCR) 法とは、ヘアピン構造を持った核酸の自己触媒的な伸長反応1)を利用して、標識したDNA等に組織切片上で連鎖的に重合反応を起こさせることで、標的核酸を可視化するin situ Hybridization法2)です。抗体反応や酵素反応を用いないためシグナル強度には直線性があり、高いシグナルノイズ比を持っています。ヘアピンDNAのHCR（重合反応）を開始させる配列を持った2つのプローブのハイブリダイゼーション、その後のHCRによって蛍光標識されたDNAが標的mRNAに特異的に結合します。
HCRは2つのプローブが正確な位置にハイブリダイゼーションしないと起こらないため、非特異的な反応が最小限に抑えられるという特長があります。本製品はヘアピンDNAをさらに短鎖化し、これまでの浸透処理は不要になりました3)。さらに1分子当たりのハイブリダイゼーションにかかる時間が減少するため、反応が早くプラトーに達し、シグナル強度も上昇するのが特長です。
1) Dirks and Pierce 2004 PNAS
2) Choi et al. 2010 Nat Biotec; 2014 ACS nano; 2018 Development
3) Tsuneoka and Funato 2020 Front. Mol. Neurosci.

Modified in situ Hybridization Chain Reaction Using Short Hairpin DNAs.
Tsuneoka Y et al.(2020) Front. Mol. Neurosci.

マウス脳切片上のVglut2（緑）、Sik3（赤）、Vgat（マゼンタ）のmRNAを検出した。各mRNA１分子はそれぞれ一つの顆粒として視認できるレベルで検出できている。

凍結切片で本製品を使用してin situ shHCRを行った場合のフローチャート。特殊な機器設備や試薬を必要とせず、ProK等による浸透処理やアセチル化、高温処理、RNase処理等は一切不要なため、簡便な手順かつ短時間で染色工程が完了します。

蛍光標識ヘアピンDNAについて、一般的なオリゴメーカーによるPAGE精製品と当社オリジナルのPAGE精製品とで染色比較した。東邦大学と共同開発した当社オリジナルのPAGE精製品の方が蛍光標識率が高く反応性も良いため蛍光シグナルが強くなる。マウス肝臓（Albumin, Cyp2e1, Glul）

マウス脳切片上のPenk（上段）、Vglut2（中段）、Nts（下段）のmRNAを、従来のHCR法および当社製品で検出し、そのシグナル強度を比較した。当社の短鎖化したヘアピンにより浸透と反応性が上昇していることが分かる。どちらもProK処理なし。

ご注文は注文フォーム（Word : 87KB）に必要事項をご記入の上、受注専用アドレス
（ish-jutaku@nepagene.jp）まで、Eメール添付にてお送り下さい。

→各ヘアピンDNAの配列情報はこちら（Excel：11KB）

通常販売品とは異なるヘアピンDNAと標識の組み合わせや、特注品ヘアピンDNA（下記生物種対応表参照）、その他の標識品（ビオチン、Cy5等）について、受注生産にてご注文承ります。お気軽にご相談ください。

※SaraFluor™ 488：国内メーカーが製造している退色に強い色素

SaraFluor™ 488のページはこちら

◎：これまでに染色実績あり。検討した組織で非特異的反応がほとんど起こらないことを確認。
〇：BLAST検索でヘアピンイニシエーターと交差するmRNA配列がヒットしない。非特異的反応が起こらないと予想される。
△：BLAST検索でヘアピンイニシエーターと交差する可能性のあるmRNA配列がヒットした。発生段階や組織の種類によっては非特異的反応が起こる可能性がある。
※その他の生物種に関しても現在検討中です。ネガティブコントロールで非特異的反応が無いこと等を確認してお使いいただけます。
※特注品ヘアピンDNA（S10、A111、A127）についてはお問い合わせ下さい。

→各種ヘアピンDNAの配列情報での対応の確認方法はこちら

プローブ受託設計を承ります。設計対象配列から、Tm値やGC含有率を考慮した最適なプローブ配列を選出し、ヘアピンDNAの結合配列を付加したプローブ配列情報を納品いたします。

※ご提供した配列情報を元にオリゴ合成メーカーにご自身で発注していただく必要があります。
※プローブをご自身で設計されたい方はユーザーマニュアルを参照してください。

→注文フォームはこちらよりダウンロード（Word : 87KB）

→設計プローブの一例(ポジティブコントロール:Gapdh)はこちら（Excel : 10KB）

ターゲットプローブは1領域当たり5’側と3’側に2種類設計しています。1種類だけのハイブリダイゼーションでは検出することができませんので、ターゲットプローブを片方のみ入れたものをネガティブコントロールとして使用して頂けます。

プロトコル

簡易イラストプロトコル

試薬レシピ

ターゲットプローブ設計方法

トラブルシューティング(開発者である東邦大学恒岡先生のページへのリンク)

ISHpalette™ Short hairpin amplifier (JP)

ISHpalette™ Hybridization buffer (JP)

ISHpalette™ Amplification buffer (JP)

現在、染色結果をフィードバックをしていただける ユーザー様を募集しています。フィードバックしていただいた場合には特典をご用意しております(Short hairpin amplifierまたはBufferをどれかおひとつご提供いたします)。 ご協力いただける方はネッパジーンまでお気軽にお問い合わせください。

※本製品は研究用です。臨床用途には使用できません。

※ISHpalette™ は東邦大学 医学部 解剖学講座微細形態学分野 准教授 恒岡洋右先生が開発された技術（特許出願中: 特願2020-102648）を用いて、共同で開発・製品化を行っております。