脳・脳切片・培養脳組織へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入

脳・脳切片・培養脳組織へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入

アプリケーション

エレクトロポレーション法による成体ラット脳への遺伝子導入

図A:10週齢雌ラットの (左右) 内側視索前核へのエレクトロポレーション4日後のGFP発現蛍光画像 (*印は電極の一部が存在した位置を示す。)

図B:図Aの強拡大画像(対物60×レンズ)。GFPシグナルは主として細胞体の核周囲部に認められる。

図C:免疫染色により内側視索前核ならびに視索前野室周囲核に存在するエストロゲンα受容体を染色。3Vは第三脳室

図D:Cの強拡大画像 (対物60×レンズ) 。エストロゲンα受容体シグナルは主に細胞核に認められる。

 

北海道大学病院 高次口腔医療センター 白川哲夫先生 提供

エレクトロポレーション法による海馬組織切片への遺伝子導入

1)エレクトロポレーションのセットアップ略図

マウス胎児の海馬切片をミリポアフィルター上に置き、DNAバッファー5μl(DNA濃度:1μg/μl)を海馬切片の上から滴下します。

ニードル白金電極(CUY611P3-1)をDNAバッファー表面に接触させます。

エレクトロポレーション後、海馬切片を冷たいHBSS溶液の入ったシャーレに戻します。

2)培養ラット胚脊髄神経管への蛍光タンパク質遺伝子の導入

図(a~c) エレクトロポレーション後3日目の器官培養した海馬組織切片のeGFP発現(使用したプロモーター a:CAG, b:Tα1, c:β-actin)

図(d, e) 成長した海馬ニューロンは、エレクトロポレーション後培養され14日間に渡りeGFP発現(β-actin)が維持されました。

図(d)の四角領域を拡大したものが図(e)で、樹状突起の矢印部分に樹状突起スパインが見られます。

図(f, g) Tα1X4-eGFPとTα1X4-mRFP1を1対1の割合で混合して、エレクトロポレーション後7日目の海馬ニューロン。単一細胞の中で、eGFP蛍光(f)とmRFP1蛍光(g)の両方を観察することができます。

図(h) 4つの異なったプロモーター配列(β-actin, CAG, Tα1, CMV)を有するeGFP発現プラスミドにおけるエレクトロポレーション後の海馬組織切片の蛍光強度の比較。組織切片は4日間培養後に固定され、共焦点顕微鏡を使用し蛍光強度を測定しました。(単位領域ごとに)

図(i) 2つの異なる発育ステージ(E15.5, E16.5)におけるエレクトロポレーション後の海馬組織切片の蛍光強度の比較。組織切片は4日間培養後に固定され、共焦点顕微鏡を使用し蛍光強度を測定しました。

図(a~d, f, g)スケールバー:50μm、図(e)スケールバー:10μm

 

東京大学 大学院医学系研究科・医学部 神経細胞生物学 岡部繁男先生 提供
※Neuroreport, Volume 15, Issue 6, Pages 971-975, April 29, 2004 参考

文献

エレクトロポレーション

ドラッグデリバリー・遺伝子導入

電気式細胞融合

蛍光組織染色・in situ HCR

細胞分離

1細胞回収・マイクロダイセクション

細胞凍結

細胞・微生物培養(解析・計数・伸展・灌流)

In vivo 超音波イメージング

卵振動培養