酵母・菌類へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入

酵母・菌類へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入

アプリケーション

多段階方式エレクトロポレーション法による酵母への高効率遺伝子導入

酵母(単細胞真核生物)懸濁液に対して、ELEPO21を用いた多段階エレクトロポレーション法と従来エレクトロポレーション法(エクスポネンシャル方式、パルス1回)による遺伝子導入の比較試験を行った。 酵母(本実験では、出芽酵母FY24を使用)のEP用コンピテントセルの調製は対数増殖期の細胞を回収し常法により行った。 当該EP用コンピテントセル(1サンプルあたり菌数108~1010、1Mソルビトール溶液)、酵母用ベクター(本実験はpAS2を使用、1サンプルあたり50ng)を混合し、当該混合液20μlを1mm gapキュベット電極(EC-001 ネッパジーン社製)内に注入した。 なお、当該一連の操作は、氷上にて冷却しながら行った。 酵母およびDNA混合液を注入したキュベット電極をELEPO21に接続したキュベット電極用チャンバーに挿入し、下記の電気パルス条件にて3段階方式のエレクトロポレーション処理を行った。

[ELEPO21 電気条件]
Poring Pulse(電圧:500V, パルス幅:1.5msec, パルス間隔:50ms, 回数:5回, 極性:+)
Transfer Pulse(電圧:50V, パルス幅:50msec, パルス間隔:50ms, 回数:5回, 極性:+/-

一方、比較実験として、エクスポネンシャル出力でのエレクトロポレーター装置(ECM630, BTX社製)を用いたこと以外は同様に操作し、下記の電気パルス条件でのエレクトロポレーション処理(高電圧エクスポネンシャルパルス)を行った。

[ECM630 電気条件]
電圧:750V, Resistance:200Ω, Capacitance:25μF

その後、各種栄養要求性の選択寒天培地上にプレーティングし、プラスミドの導入により選択培地で生育したコロニー数をカウントした。 プラスミド1μgあたりのコロニー数を算出し、遺伝子導入効率(cfu/μg)として評価した。
※出芽酵母の場合のみ、1Mソルビトール含有の選択寒天培地を用い浸透圧を調整しておくことにより導入効率が1桁よくなる報告がある。

実験結果

[図1: ELEPO21結果]

[図2: ECM630結果]

図3

図1・図2に示すように、酵母の懸濁液(サンプル抵抗値:約12.36 KΩ)に対して、多段階方式エレクトロポレーター装置(ELEPO21)を用いて電気パルス処理を行うことによって、極めて高い遺伝子導入効率が実現できることが示された。 従来のエクスポネンシャル出力でのエレクトロポレーター装置(ECM630)を用いて高電圧パルス処理を行った場合よりも、約6.3倍も高い遺伝子導入効率が達成できることが示された。(図3)

※当該遺伝子導入実験は2反復で行い、平均値を算出した。
※ELEPO21とECM630の電気条件は、事前に検討した最適条件を使用。

文献

エレクトロポレーション

ドラッグデリバリー・遺伝子導入

電気式細胞融合

蛍光組織染色・in situ HCR

細胞分離

1細胞回収・マイクロダイセクション

細胞凍結

細胞・微生物培養(解析・計数・伸展・灌流)

In vivo 超音波イメージング

卵振動培養