受精卵へのエレクトロポレーションによるゲノム編集（TAKE法）

• エレクトロポーション法（電気穿孔法）を用いて、遺伝子改変動物（ラット）の作製に世界で初めて成功した。
• 本方法を用いて、近年注目されているZFN, TALEN, CRISPR-Casの受精卵への導入に成功し、ゲノム編集技術の加速化を推進させる技術として利用できる。
• エレクトロポーション法は、マイクロインジェクション法よりも操作が容易であり、熟練した作業者が不在の研究機関・研究室で、目的遺伝子を改変した動物を容易に作製することができる。
• 多くの動物種の受精卵への遺伝子導入に応用可能であり、研究に適した動物種を用いて短期間で遺伝子改変動物を準備することができ、研究効率を向上できる（マウス・ラットのノックアウト・ノックインにも成功）。
• 本技術は、Technique for Animal Knockout system by Electroporation（TAKE法：テイク法）と命名した。

本研究では、写真A：NEPA21スーパーエレクトロポレーター（ネッパジーン社）と写真B：CUY520P5シャーレ白金プレート電極 5mm gap（ネッパジーン社）を使用して、図C：3ステップの電気穿孔を設定し、1ステップ目の電気パルスで細胞に穴を空け、2ステップ及び3ステップ目の電気パルスで遺伝子を導入するという段階的な方法で、効率的に受精卵内へ遺伝子を導入した。（図D）

胚に外来物質をエレクトロポレーションで導入する際の条件検討の為に、テトラメチルローダミンでラベルされたデキストラン（3kDa、可視化が容易で細胞毒性が無い）を用いた。 前核期の胚は、交尾後一日経過した過剰排卵メスラットより採取した。 テトラメチルローダミンでラベルされたデキストランをパルス幅：0ms（コントロール）, 0.5ms, 1.5ms, 2.5msecの条件でラット胚にエレクトロポレーションした。 デキストランは胚の細胞質全体に導入された。（写真E）

標的遺伝子は、X連鎖重症複合免疫不全症（X-SCID）の原因遺伝子であるインターロイキン2受容体γ鎖（Il2rg）遺伝子として、ZFN, TALEN, CRISPR-CasのmRNAを作製した。 NEPA21に接続したCUY520P5シャーレ電極にmRNAを混合した溶液を満たし、そこへ受精卵を入れてTAKE法のエレクトロポレーションによりmRNA導入を行った。 導入後の受精卵は、雌親へ移植し産子にまで育てた。 その結果、ZFN, TALEN, CRISPR-Casの全てにおいて、目的の遺伝子が破壊された産子を得ることに成功した。

これまで、遺伝子改変動物の作製には繊細かつ熟練した技術が必要とされ、そのことが研究遂行の妨げになっていた。 今回開発したTAKE法を用いることにより、簡易に短期間で目的の遺伝子を改変した動物を作製することが可能となった。 本研究成果は、遺伝子改変動物を必要とする研究の加速化に大いに貢献できるものであり、今後他の動物種での成功が期待される。

京都大学大学院医学研究科　附属動物実験施設　金子武人先生・真下知士先生

※Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos, Scientific Reports 4: 6382 DOI: 10.1038/srep06382　参考