ニワトリ(In Ovo・その他)へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入

ニワトリ(In Ovo・その他)へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入

アプリケーション

In Ovoエレクトロポレーション法によるニワトリ脳胞への遺伝子導入

  1. ニワトリ1.5日胚の脳胞へFast Greenを含むプラズミド溶液(青色)を注入する。
  2. 脳胞の左右に平行電極を置き、25V、50msの電圧を1秒間隔で4回かける。
  3. GFP遺伝子を導入した場合、24時間後にはGFP蛍光が各脳胞で強く検出される。
  4. GFP遺伝子導入48時間後でもGFP蛍光が検出される。
  5. 図4の胚を上部から見ると、遺伝子導入は胚の右側の脳胞に限局されていることがわかる。

本方法により、転写因子(Engrailed, Pax, Otx2, Gbx2)、分泌因子(Fgf, Shh, Semaphorin)、受容体(Neuropilin)などの局所導入をおこない、脳胞の形態変化、領域の改変、軸索走行の異常、下流遺伝子の発現変化などが検出される。
また、siRNAの導入による遺伝子発現抑制実験も可能である。

 

東北大学生命科学研究科 加齢医学研究所 仲村春和先生・渡邉裕二先生 提供
※Development Growth & Differentiation, Volume 42, Issue 3, Page 199-201, June 2000 参考

 

エレクトロポレーション法を用いたニワトリ胚でのsiRNAによる遺伝子機能阻害法

in ovo electroporation

  1. プラスミド液を神経管内に吹き入れ、電極を卵黄膜の上に置く。 25V、50msec/secの矩形波を4回流す。
  2. 転写によってヘアピン型siRNA (shRNA)が形成される配列をデザインし、U6プロモーターやH1プロモーターを持つ発現ベクターに組み込む。 当研究室では、マウスのU6プロモーターを持つベクターを用いているが、ニワトリ胚でも効果がある。
  3. 転写後、ヘアピン部分が消化され、siRNAとなりRISC(RNA induced silencing complex)を形成し、標的遺伝子のmRNAを分解する。

エレクトロポレーション後24時間

  1. 導入効率を共導入したGFPにより検出。
  2. En2に対するshRNAを設計。 in situ hybridizationによってmRNAの分解を検出した。
  3. En2の正常な発現。エレクトロポレーション法とsiRNA法を組み合わせることで、簡便な遺伝子の機能阻害法を実現できる。

東北大学生命科学研究科 加齢医学研究所 仲村春和先生・片平立矢先生 提供

※Mechanisms of Development, Volume 121, Issue 9, Pages 1137-1143, September 2004 参考

 

ニワトリ初期胚(原腸陥入胚)への遺伝子導入

  1. Newカルチャーエレクトロポレーションの模式図
  2. DNA溶液(FastGreenにより青緑色がついている)をステージ4ニワトリ胚の予定神経板領域に注入したところ。hn:ヘンゼン結節、ps:原始線条、ao:area opaca、ap:area pellucida
  3. DNA溶液のインジェクションの模式図 卵黄膜と予定神経板の隙間に注入する。

プロトコル:

  1. 濾紙リングに胚を貼り付け、卵より取り出す。
  2. 余分な卵黄を洗い、陰極チャンバーのプラットフォーム上に静置する。
  3. ガラスニードルを用いてDNA溶液を卵黄膜と外胚葉の隙間に注入する(外胚葉系組織に導入する場合)。
  4. 標的部位を陰極板上に設置し、陽極をその上に設置する(電極間は5mm)。
  5. 設定電圧10V、パルス時間50ms、パルス間隔100ms、回数5回のパルスをかける。
  6. 卵白寒天プレート上に移し、39℃で培養する。

エレクトロポレーション後の導入遺伝子の発現

プロトコールの条件でステージ4の予定神経板領域にGFP遺伝子を導入し、蛍光実体顕微鏡下で経時的にステージ17(約34時間後)まで観察した例を示す。

導入されたGFP遺伝子は、エレクトロポレーション後約3時間頃より発現が観察され、中枢神経系と頭部表皮に強く発現していた。

さらに、標的領域における陽性細胞を定量したところ、約80%以上の細胞が発現していた。

他の部位への導入

ニワトリ胚の予定運命地図に基づいて、導入時期、導入部位、電極の設置部位を変えることにより、体節、血球系、側板、脊索などに発現させることが可能である。

  1. 体節
  2. 血球系
  3. 脊索
  4. 側板
  5. ~H. A~Dの拡大した例

 

熊本大学発生医学研究センター 形態形成分野 嶋村健児先生 提供

※メディカル ドゥ社「図・写真で観る発生・再生実験マニュアル」 転載

 

エレクトロポレーション法によるニワトリ胚消化器官への遺伝子導入

  1. ウェッケルの刃の片方を前胃の内腔に挿入し、切開しPBS(-)に移す。
  2. ゲルを電極におさまるように適当な大きさに剃刀で切り、PBS(-)に浸しておく。
  3. ゲルを電極に納め、周囲をPBS(-)で満たす。 ウェルの内側のPBS(-)をピペットマン(P200)で丁寧に吸い取って除き、プラスミドDNA溶液(12~15μl)で満たす。 前胃を上皮が陰極に向くようにして入れる。
  4. 設定電圧30V、パルス時間50msの電圧を、75msの間隔で15回掛ける。 ただちにゲルを取り出し、サリエールに入れたダイロード液で濯ぐ。 前胃を取り出し、新たなダイロード液に移す。

腺形成のメカニズムを研究するために、上皮細胞に種々の遺伝子を導入し、その機能解析を行っている。 ここでは、その対照実験として、5.5日胚前胃の上皮に、GFP発現ベクターをエレクトロポレーション法で導入した例を示す。

2日間培養後、導入した遺伝子(GFP)の発現が上皮のみに見られる。 上皮の陥入が始まり、cSP遺伝子の発現が消失し始めている【図1】。 3日間培養後、胃腺が形成され、内腔上皮でcSP遺伝子が正常に発現していることから、エレクトロポレーション法による異常がないことが分かる【図2】。 GFPは内腔上皮でも腺上皮でも発現している。

東京都立大学大学院理学研究科生物科学専攻 八杉貞雄先生 提供

文献

エレクトロポレーション

ドラッグデリバリー・遺伝子導入

電気式細胞融合

蛍光組織染色・in situ HCR

細胞分離

1細胞回収・マイクロダイセクション

細胞凍結

細胞・微生物培養(解析・計数・伸展・灌流)

In vivo 超音波イメージング

卵振動培養