大腸菌・バクテリアへのエレクトロポレーションによる遺伝子導入

ELEPO21エレクトロポレーション装置

ｷｭﾍﾞｯﾄ電極用ﾁｬﾝﾊﾞｰ･ﾗｯｸ

NEPAｷｭﾍﾞｯﾄ電極

大腸菌・バクテリアへのエレクトロポレーションによる遺伝子導入

アプリケーション

多段階方式エレクトロポレーション法による大腸菌への高効率遺伝子導入

大腸菌（グラム陰性菌）懸濁液に対して、ELEPO21を用いた多段階エレクトロポレーション法と従来エレクトロポレーション法（エクスポネンシャル方式、パルス1回）による遺伝子導入の比較試験を行った。大腸菌（DH5α）のEP用コンピテントセルの調製は対数増殖期の細胞を集菌し常法により行った。当該EP用コンピテントセル（1サンプルあたり菌数109～1011　10％グリセロール溶液）、pUC19ベクター（1サンプルあたり10pg）を混合し、当該混合液20μlを1mm gapキュベット電極（EC-001　ネッパジーン社製）内に注入した。なお、当該一連の操作は、氷上にて冷却しながら行った。大腸菌及びDNA混合液を注入したキュベット電極をELEPO21に接続したキュベット電極用チャンバーに挿入し、下記の電気パルス条件にて3段階方式のエレクトロポレーション処理を行った。

ELEPO21　電気条件

  • Poring Pulse（電圧：2,000V, パルス幅：2.5msec, パルス間隔：50ms, 回数：1回, 極性：+）
  • Transfer Pulse（電圧：150V, パルス幅：50msec, パルス間隔：50ms, 回数：5回, 極性：+/-）

一方、比較実験として、エクスポネンシャル出力でのエレクトロポレーター装置（ECM630, BTX社製）を用いたこと以外は同様に操作し、下記の電気パルス条件でのエレクトロポレーション処理（高電圧エクスポネンシャルパルス）を行った。

ECM630　電気条件

  • 電圧：2,000V, Resistance：200Ω, Capacitance：25μF

その後、アンピシリン含有LB寒天培地上にプレーティングし、pUC19DNAの導入により薬剤耐性を獲得して生育したコロニー数をカウントした。プラスミド1μgあたりのコロニー数を算出し、遺伝子導入効率（cfu/μg）として評価した。

実験結果

E. coli への遺伝子導入結果

大腸菌の懸濁液 (サンプル抵抗値：約7.7KΩ) に対して、多段階方式エレクトロポレーター装置 (ELEPO21) を用いて電気パルス処理を行うことによって、極めて高い遺伝子導入効率が実現できることが示された。従来のエクスポネンシャル出力でのエレクトロポレーター装置 (ECM630) を用いて高電圧パルス処理を行った場合よりも、約4.9倍も高い遺伝子導入効率が達成できることが示された。
※当該遺伝子導入実験は2反復で行い、平均値を算出した。

※ELEPO21とECM630の電気条件は、事前に検討した最適条件を使用。

 

文献

  • Kp-2H7

ヒト腸内Kp-2H7菌株

Commensal consortia decolonize Enterobacteriaceae via ecological control

Furuichi M, Kawaguchi T, Pust MM, Yasuma-Mitobe K, Plichta DR, Hasegawa N, Ohya T, Bhattarai SK, Sasajima S, Aoto Y, Tuganbaev T, Yaginuma M, Ueda M, Okahashi N, Amafuji K, Kiridoshi Y, Sugita K, Stražar M, Avila-Pacheco J, Pierce K, Clish CB, Skelly AN, Hattori M, Nakamoto N, Caballero S, Norman JM, Olle B, Tanoue T, Suda W, Arita M, Bucci V, Atarashi K, Xavier RJ, Honda K.

Nature. 2024 Sep 18.

  • 黄色ブドウ球菌

Phagemid-based capsid system for CRISPR-Cas13a antimicrobials targeting methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Li FY, Tan XE, Shimamori Y, Kiga K, Veeranarayanan S, Watanabe S, Nishikawa Y, Aiba Y, Sato'o Y, Miyanaga K, Sasahara T, Hossain S, Thitiananpakorn K, Kawaguchi T, Nguyen HM, Yeo Syin Lian A, Sultana S, Alessa O, Kumwenda G, Sarangi J, Revilleza JEC, Baranwal P, Faruk MO, Hidaka Y, Thu M, Arbaah M, Batbold A, Maniruzzaman, Liu Y, Duyen HTM, Sugano T, Tergel N, Shimojyo T, Cui L.

Commun Biol. 2024 Sep 13;7(1):1129.

  • 黄色ブドウ球菌

Efficient synthesis of CRISPR-Cas13a-antimicrobial capsids against MRSA facilitated by silent mutation incorporation

Shimamori Y, Tan XE, Li FY, Nishikawa Y, Watanabe S, Sasahara T, Miyanaga K, Aiba Y, Veeranarayanan S, Thitiananpakorn K, Nguyen HM, Batbold A, Nayanjin T, Lian AYS, Hossain S, Kawaguchi T, Alessa O, Kumwenda G, Sarangi J, Revilleza JEC, Baranwal P, Arbaah M, Maniruzzaman, Yi L, Duyen HTM, Sugano T, Sultana S, Faruk MO, Hidaka Y, Thu M, Shimojyo T, Kiga K, Cui L.

Sci Rep. 2024 Jul 13;14(1):16225.

  • 大腸菌

Synthetic phage-based approach for sensitive and specific detection of Escherichia coli O157

Tamura A, Azam AH, Nakamura T, Lee K, Iyoda S, Kondo K, Ojima S, Chihara K, Yamashita W, Cui L, Akeda Y, Watashi K, Takahashi Y, Yotsuyanagi H, Kiga K.

Commun Biol. 2024 May 6;7(1):535.

  • コリネバクテリウム

A 4-hydroxybenzoate 3-hydroxylase mutant enables 4-amino-3-hydroxybenzoic acid production from glucose in Corynebacterium glutamicum

Kyoshiro Nonaka, Tatsuya Osamura, Fumikazu Takahashi

Microb Cell Fact. 2023 Aug 29;22(1):168.

  • 黄色ブドウ球菌

Development of CRISPR-Cas13a-based antimicrobials capable of sequence-specific killing of target bacteria

Kotaro Kiga, Xin-Ee Tan, Rodrigo Ibarra-Chávez, Shinya Watanabe, Yoshifumi Aiba, Yusuke Sato'o, Feng-Yu Li, Teppei Sasahara, Bintao Cui, Moriyuki Kawauchi, Tanit Boonsiri, Kanate Thitiananpakorn, Yusuke Taki, Aa Haeruman Azam, Masato Suzuki, José R Penadés, Longzhu Cui

Nat Commun. 2020 Jun 10;11(1):2934.

  • ブドウ球菌

Optimized Universal Protocol for Electroporation of Both Coagulase-Positive and -Negative Staphylococci

Yusuke Sato'o, Yoshifumi Aiba, Kotaro Kiga, Shinya Watanabe, Teppei Sasahara, Yasuhiko Hayakawa, Longzhu Cui

J Microbiol Methods . 2018 Mar;146:25-32.

  • Edwardsiella_tarda

Three-dimensional visualization of green fluorescence protein-labelled Edwardsiella tarda in whole Medaka larvae

C Kataoka, H Tomiyama, S Kashiwada

J Fish Dis . 2017 Apr;40(4):479-484.

  • 黄色ブドウ球菌

Efficient transformation of Staphylococcus aureus using multi-pulse electroporation

Junzo Hisatsune, Yusuke Sato'o, Liansheng Yu, Shoko Kutsuno, Yasuhiko Hayakawa, Motoyuki Sugai

J Microbiol Methods, 2016 Nov;130:69-72.

エレクトロポレーション

ドラッグデリバリー・遺伝子導入

電気式細胞融合

蛍光組織染色・in situ HCR

細胞分離

1細胞回収・マイクロダイセクション

細胞凍結

細胞･微生物培養 (解析/計数/伸展/灌流)

In vivo 超音波イメージング

卵振動培養