卵管内の受精卵へのエレクトロポレーションによるゲノム編集（i-GONAD法）

NEPA21エレクトロポレーション装置

Sピンセット電極

ｹｰﾌﾞﾙ･ﾌｯﾄｽｲｯﾁ

卵管内の受精卵へのエレクトロポレーションによるゲノム編集（i-GONAD法）

アプリケーション

rGONAD法によるゲノム編集ラットの作製

rGONAD法におけるエレクトロポレーションの条件の最適化

  1. GONAD法におけるエレクトロポレーション効率評価の実験手順
  2. 実体顕微鏡 SZX7（オリンパス社）とスーパーエレクトロポレーター NEPA21（ネッパジーン社）
  3. マイクロピペットを用いて、テトラメチルローダミン標識デキストランを卵管采付近の卵管壁を通して卵管内腔に注入
  4. インジェクション後、卵管領域をPBSで浸した適度な大きさに切ったキムワイプで覆いCUY652P2.5X4（Sピンセットお椀白金電極　2.5mm×4mm、ネッパジーン社）を使用してエレクトロポレーションを実施　Ova：卵巣、Ovi：卵管、Ute：子宮
  5. エレクトロポレーションのパルス波形
  6. NEPA21の設定電気条件
    • Poring Pulse　電圧：40V、パルス幅：5msec、パルス間隔：50msec、回数：3回、減衰率：10％、極性：+/-（切替あり）
    • Transfer Pulse　電圧：10V、パルス幅：50msec、パルス間隔：50msec、回数：6回、減衰率：40％、極性：+/-（切替あり）
  1. h. テトラメチルローダミン標識デキストランの蛍光分析　スケールバー：50µm
  2. ラットWKYにおけるエレクトロポレーション効率の蛍光分析グラフ
  3. ラットDAにおけるエレクトロポレーション効率の蛍光分析グラフ
  4. ラットDA×WKYにおけるエレクトロポレーション効率の蛍光分析グラフ

rGONAD法によるTry遺伝子ノックアウト（KO）ラットの作製

  1. KOラットにおけるアレル特異的ゲノム編集。
    • ダークアグーチ(DA)系統のラットと交配させた妊娠0.75日のアルビノ（WKY）ラットでrGONAD法を実施した。
    • 受精卵は(WKY×DA)F1ハイブリット。Tyr遺伝子座における標的の配列及びPAM配列。
  2. 編集中のラットには、アルビノの毛色を持つものもいた。
  3. 野生型F1（上段：WT）または編集型（下段：インデル）、ラットのダイレクトシーケンスの解析結果。赤矢印は、インデル変異。
  4. 仔の配列解析では、赤で示すようにTyr遺伝子座に様々なインデル変異が認められた。
  5. WKY雌×DA雄におけるＴｙｒ遺伝子のゲノム編集効率の分析。
  6. DA雌×WKY雄におけるＴｙｒ遺伝子のゲノム編集効率の分析。

ノックイン（KI）法を用いたアルビノWKYラットにおける毛色変異の修復

  1. 毛色変異の修復のスキーム
    • WKY雄ラットと交配させた妊娠0.75日目のWKY雌ラットにrGONAD法を実施。
    • Tyr遺伝子座における標的配列、PAM配列、およびssODNの図。
  2. 非アグーチで頭巾斑型のアルビノのKIラット

F1（WKY x DA）ラットのTyrを介した変異

 

Kobayashi et al., BMC Biotechnology (2018)より一部引用。
データ提供：重井医学研究所　分子遺伝部門　松山誠先生

文献

  • ノックインマウス

Spatial organizations of heterochromatin underpin nuclear structural integrity of ventricular cardiomyocytes against mechanical stress

Fujiwara K, Inoue T, Kimoto A, Zixian J, Tokuhiro K, Yasukochi Y, Akama TO, Cai CL, Shiojima I, Kimura H, Yoshimura SH, Nakamura T, Hirai M.

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  • ノックアウトマウス

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  • ノックアウトマウス

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  • ノックインマウス

Phosphorylation of phase-separated p62 bodies by ULK1 activates a redox-independent stress response

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  • ノックインマウス

A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes

Abe M, Nakatsukasa E, Natsume R, Hamada S, Sakimura K, Watabe AM, Ohtsuka

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  • ノックアウトラット

Neuromedin U-deficient Rats do not Lose Body Weight or Food Intake

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  • ノックアウトマウス
  • ノックインマウス

Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method

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Generation of a recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model with patient-derived compound heterozygous mutations

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  • ノックアウトマウス

Loss of Atg2b and Gskip Impairs the Maintenance of the Hematopoietic Stem Cell Pool Size

Shun-Suke Sakai, Atsushi Hasegawa, Ryosuke Ishimura, Naoki Tamura, Shun Kageyama, Satoko Komatsu-Hirota, Manabu Abe, Yiwei Ling, Shujiro Okuda, Manabu Funayama, Mika Kikkawa, Yoshiki Miura, Kenji Sakimura, Ichiei Narita, Satoshi Waguri, Ritsuko Shimizu, Masaaki Komatsu

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  • ノックアウトラット

Creation of X-linked Alport Syndrome Rat Model with Col4a5 Deficiency

Masumi Namba, Tomoe Kobayashi, Mayumi Kohno, Takayuki Koyano, Takuo Hirose, Masaki Fukushima, Makoto Matsuyama

Sci Rep . 2021 Oct 21;11(1):20836

  • ノックアウトマウス
  • ノックインマウス
  • ノックアウトラット
  • ノックインラット

GONAD: A new method for germline genome editing in mice and rats

Masumi Namba, Tomoe Kobayashi, Takayuki Koyano, Mayumi Kohno, Masato Ohtsuka, Makoto Matsuyama

Dev Growth Differ. 2021 Aug 25.

  • ノックインマウス

Functional validation of epitope-tagged ATF5 knock-in mice generated by improved genome editing of oviductal nucleic acid delivery (i-GONAD)

Haruo Nakano, Shiori Kawai, Yusaku Ooki, Tomoki Chiba, Chiharu Ishii, Takumi Nozawa, Hisako Utsuki, Mariko Umemura, Shigeru Takahashi, Yuji Takahashi

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  • ノックアウトマウス

An efficient i-GONAD method for creating and maintaining lethal mutant mice using an inversion balancer identified from the C3H/HeJJcl strain

Satoru Iwata, Takahisa Sasaki, Miki Nagahara, Takashi Iwamoto

G3 Genes|Genomes|Genetics, jkab194, 03 June 2021

  • ノックアウトマウス

Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts

Takehito Kaneko, Shungo Tanaka

Biochem Biophys Res Commun. 2020 Jul 5;527(4):1039-1042.

  • ノックアウトマウス

In utero gene transfer system for embryos before neural tube closure reveals a role for Hmga2 in the onset of neurogenesis

Kuwayama N, Kishi Y, Maeda Y, Nishiumi Y, Suzuki Y, Koseki H, Hirabayashi Y, Gotoh Y.

bioRxiv May 15, 2020

  • ノックインマウス

Sequential i-GONAD: An Improved In Vivo Technique for CRISPR/Cas9-Based Genetic Manipulations in Mice

Masahiro Sato, Rico Miyagasako, Shuji Takabayashi, Masato Ohtsuka, Izuho Hatada, Takuro Horii

Cells, 9 (3) 2020 Feb 26

  • ノックアウトマウス

Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes via in vitro and in vivo electroporation.

Iwata S, Nakadai H, Fukushi D, Jose M, Nagahara M, Iwamoto T

Sci Rep. 2019 Oct 11;9(1):14713.

  • ノックアウトマウス

The p21 dependent G2 arrest of the cell cycle in epithelial tubular cells links to the early stage of renal fibrosis.

Koyano T, Namba M, Kobayashi T, Nakakuni K, Nakano D, Fukushima M, Nishiyama A, Matsuyama M.

Sci Rep . 2019 Aug 19;9(1):12059.

  • ノックアウトラット
  • ノックインラット

i-GONAD (improved genome-editing via oviductal nucleic acids delivery), a convenient in vivo tool to produce genome-edited rats.

Takabayashi S, Aoshima T, Kabashima K, Aoto K, Ohtsuka M, Sato M

Sci Rep. 2018 Aug 13;8(1):12059.

  • ノックアウトラット
  • ノックインラット

Successful production of genome-edited rats by the rGONAD method.

Kobayashi T, Namba M, Koyano T, Fukushima M, Sato M, Ohtsuka M, Matsuyama M

BMC Biotechnol. 2018 Apr 2;18(1):19

エレクトロポレーション

ドラッグデリバリー・遺伝子導入

電気式細胞融合

蛍光組織染色・in situ HCR

細胞分離

1細胞回収・マイクロダイセクション

細胞凍結

細胞･微生物培養 (解析/計数/伸展/灌流)

In Vivo イメージング・モニタリング

卵振動培養