電気式細胞融合による四倍体胚の作出

電気式細胞融合による四倍体胚の作出

アプリケーション

核移植によるメラノーマゲノムのリプログラミング

図1. 癌細胞からマウスを作るための2段階のクローニング手順

除核卵母細胞への核移植のために、種類の異なる腫瘍細胞をドナーとして使用した。 ES細胞を作るために、得られた胚盤胞を培地へ移植した。 ES細胞の発癌と分化の可能性をSCIDマウスに奇形腫を生じさせin vitroで評価し(1)、キメラマウスと完全にES細胞に由来するマウスを作るために、細胞を2倍体(2)・4倍体(3)の胚盤胞へ注入してin vivoで評価した。

図2. R545-1 ES細胞の発生の潜在性の分析

a) 核移植による肺癌細胞由来の胚盤胞のハッチングで、卵割腔・栄養外胚葉層・内細胞塊が見られる。

b, c) R545-1ES細胞から作られた奇形腫部のH&E染色により、成熟神経細胞・間葉細胞・扁平上皮細胞への分化が見られ(b)、円柱上皮細胞・軟骨細胞・含脂肪細胞の分化が見られる(c)。

d-f) GFPラベルしたES細胞の新生キメラマウスへの寄与。 上段は、キメラマウスの頭(d)・心臓(e)・腸(f)のGFP像。 下段は、位相差顕微鏡下での同じ像。

g) Rag2/R545-1 ES細胞キメラの末梢血FACS分析で、FITC-IgM/PE-B220抗体を使ったB細胞とFITC-CD4/PE-CD8抗体を使ったT細胞の存在が示されている。

h) R545-1細胞の皮膚への寄与によりメラニン細胞への分化が示されている。 矢印はキメラマウスのの目と首の腫瘍の自然発生を示している。

i) 4倍体補完法で完全にES細胞から作られた胚が、明らかな尾芽と肢芽・閉鎖した神経管・鼓動を打つ心臓を伴ってE9.5へ成長している。

図3. キメラマウスの癌の表現型

a) メラノーマドナーマウス(上段)と核移植キメラマウス(下段)の腫瘍発生潜伏期間の比較。 ドキシサイクリン再投与後、核移植キメラの腫瘍発生潜伏期間がドナーマウスと似通っていることに注目。(再発性腫瘍)

b-d) R545-1核移植キメラに形成した腫瘍の代表的な写真と免疫組織染色。 矢印は腫瘍の成長部分を示している。 H&E染色とメラニン特異のTRP-1抗体・筋肉特異のデスミン抗体MPNSTを検出するGFAP抗体・S-100抗体による免疫組織染色により、メラノーマ(b)・横紋筋肉腫(c)・悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST:d)が確認された。

Massachusetts Institute of Technology, Whitehead Institute for Biomedical Research and Department of Biology, Konrad Hochedlinger先生, Robert Blelloch先生
Genes & Development, Volume 18, Issue 15, Pages 1875-1885, 1 August 2004 参考

文献

エレクトロポレーション

ドラッグデリバリー・遺伝子導入

電気式細胞融合

蛍光組織染色・in situ HCR

細胞分離

1細胞回収・マイクロダイセクション

細胞凍結

細胞・微生物培養(解析・計数・伸展・灌流)

In vivo 超音波イメージング

卵振動培養