作物学

作物の保護 – 微生物農薬の生存胞子数の計測

oCelloScopeの胞子カウント機能を使用すると、メタリジウム（Metharizium）、トリコデルマ（Trichoderma）、コニオチリウム（Coniothyrium）、イサリア（Isaria）、プルプレオシリウム（Purpureocillium）などの微生物農薬をカウントして、定量化することができます。この胞子カウント機能は機械学習に基づいており、小さな丸い胞子、通常のサイズの胞子、または細長い胞子を数えることが可能です。アルゴリズムは、最終的な製品におけるカウントや生存率の研究にも使用できます。「汚れた」サンプルや菌糸が含まれているサンプルでも、胞子を数えることができます。カウントは、マルチウェルプレート内の液体培地や寒天上で行えます。また、消耗品を節約できる専用のミニ寒天ディスクを12ウェルプレートに入れて使用することも可能です。

専用プログラムにより、ウェル内の胞子を特定してカウントできます（上：96ウェルプレートの例）。カウント結果は、実際の数または濃度（オブジェクト/ml）で表示されます（上の例の赤い四角を参照）。正確にカウントするには、ウェル内で細胞が均等に分布していることが重要です。分布は、ピペット操作や培地とプラスチックの温度差など、いくつかの要因によって影響を受けます。カウントを行う際には、より良い統計データを得るために広いスキャンエリア（例：80画像＝3.6mm）を設定することをお勧めします。

専用のソフトウェアであるUniExplorerで測定時間の間隔を設定し、使用する測定プログラムを選択します。結果は、Excelにエクスポートすることも可能です。

ユニークな機能として、結果をパーセントで表示することができます。上のデータでは、8つのウェルが分析されています。未発芽の胞子をカウントし、正確な発芽時間と発芽率（パーセント）が表示されています。

微生物は土壌の肥沃度や質、栄養の獲得、細胞内外の分子や代謝物の分泌を改善することができます。oCelloScopeを用いれば、遺伝子改変株の成長を最適化し、形態の適応を確認し、相互作用を非侵襲的な技術で観察するすることが可能です。

上の動画は、いくつかの真菌に侵されたニンニクのサンプルです。焦点が合っているのは、作物の収穫に大きな損失を与える植物病原菌、フサリウム（Fusarium）です。

バイオ農業の研究開発において、休眠状態から等方的成長に至るまでの胞子の成長過程は、これまで「ブラックボックス」でした。しかし、oCelloScopeの新しい追跡プログラムを使用することで、現在では集団内の各胞子を時間経過とともに追跡できます。さまざまなパラメータを用いて成長を観察し、定量化できます。さらに、サイズ分布のヒストグラムでデータを表示することも可能です。

深い分析を行う際には、既存のジョブデータを読み込んで分析を実行することをお勧めします。どのジョブデータも後から再分析することができます。

oCelloScopeを使えば、病原性菌種や新しい抗真菌薬の比較試験が可能です。研究に役立つ分析データや画像データを取得できます。上のデータは、異なる濃度の化合物Xで処理された病原性真菌です。曲線の最初の上昇は、プレートの底に胞子が沈降する様子を示しており、曲線の下降は胞子の発芽を意味します。この実験では、濃度の異なる化合物の真菌への効果が示されています。

測定プログラムの特注対応も可能です。詳しくはお問い合わせください。

上の動画では、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）とバチルス・パラリケニフォルミス（Bacillus paralicheniformis）を含む市販品の生存能力をテストしています。対象サンプルは胞子懸濁液で、実験では96ウェルプレートを用いました。最初は胞子が小さな点として見られます。液体培地に数時間置くと、胞子は栄養成長が始まります。

他に、ミニ寒天ディスクとコロニー追跡プログラムを使用して、寒天上で胞子を成長させることもできます。以下は、3つの時間点のズーム画像です。成長の速さは胞子によって異なります。

新しいプログラムにより、画像内で菌糸体を正確に検出できるようなりました。タイムラプスで1つのウェルを定量化するか、複数のウェルを比較する形で定量化を行います。菌糸体で覆われた面積、体積（バイオマス）、先端の数（分岐の指標）、および菌糸の幅を表示することができます。このモジュールは現在、発酵の最適化、形態変化の研究、ならびに真菌フィンガープリントに使用されています。

上の画像は、PDA表面上のトリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma Harzianum）の菌糸体で、菌糸体追跡プログラムのオーバーレイが表示されています。

上の動画は、oCelloScopeと24ウェルプレートを使用した共培養実験です。まず、トリコデルマ・ハルチアナム（Trichoderma harzianum）とボトリティス・シネレア（Botrytis cinerea）の胞子を、µCount3D装置を用いて5.0E+04個に調整しました。その後、胞子をウェル内の2D表面に配置しました。oCelloScopeの設定で、発芽後20分ごとに画像を取得するようにして、測定を開始しました。この動画では、トリコデルマがボトリティスをどのように攻撃するかを見ることができます。

専用のIntuGrowアッセイ（別売）を使用すると、CFU/mlを数日ではなく数時間で測定できます。選択寒天培地とミニ寒天ディスクを使用し、専用のソフトウェアで細菌の増殖をカウントします。この方法はEU GMP基準に基づいて検証されており、製薬業界の生産現場でルーチンに使用されています。