電気式細胞融合によるハイブリドーマの作製

ECFG21

細胞融合用電極

ｹｰﾌﾞﾙ･ﾌｯﾄｽｲｯﾁ

ﾓﾆﾀﾘﾝｸﾞｼｽﾃﾑ

電気式細胞融合によるハイブリドーマの作製

アプリケーション

モノクローナル抗体作製における腸骨リンパ節細胞を用いたポリエチレングリコール融合法（PEG法）、電気的融合法、センダイウィルス外膜蛋白質融合法（HVJ-E法）との比較検討

◆電気的融合法

電気的融合法は、細胞融合装置 ECFG21・LF201（ネッパジーン社製）を用いて行った。電極は、MSスタンド型チャンバー白金電極 CUY497P2（電極間隔：2mm gap, 電極サイズ：L80mm×W2mm×H5mm, 容量：0.8ml, ネッパジーン社製）を用いた（図1）。電気融合用電極液は、0.3Mマンニトール、0.1mM塩化カルシウム、0.1mM塩化マグネシウム溶液を使用した。

  1. 15ml用プラスチック製遠沈管にリンパ球とミエローマが1：1の割合になるように融合用電極液に懸濁し、遠心して上清を吸引除去した。 細胞沈査に融合用電極液を2.4ml加えて細胞懸濁液を作った。
  2. 細胞懸濁液を0.8mlずつ3回に分けて電気パルスをかけた。 細胞を接着（パールチェーンを形成）させる為の交流（周波数：1MHz、電圧：30V）を20秒間行い、細胞融合する為の直流パルス（電圧：350V、パルス幅：30μs、パルス間隔：0.5秒）を3回かけた。
  3. 融合し終えた細胞液は、1000回転5分間の遠心後、細胞沈査に10％BM-Condimed H1を添加したHAT培地を加えて攪拌し、96穴培養プレート4枚に播いた。

◆PEG法と電気的融合法の比較

マウス腸骨リンパ節細胞を用いてPEG法と電気的融合法の比較実験を行った。 2本の凍結チューブの細胞を解凍して混ぜ合わせ（約4×107個）、それを2等分し一方をPEG法で融合し、もう一方を電気的融合法で融合した。 このセットを3組行った。 3セットの融合の比較では、1.5～4.0倍の値で電気的融合法の方が多くの陽性ウェルが得られた（表1）。 平均すると2.8倍であった。

表1：マウス腸骨リンパ節法における融合法の比較

 

PEG法

陽性ウェル数

電気的融合法

陽性ウェル数

PEG法：電気的融合法

比率

1回目1662501:1.5
2回目601821:3.0
3回目652621:4.0

◆電気的融合法の考察

ラット腸骨リンパ節細胞を用いて、PEG法・電気的融合法・HVJ-E法の3種類の融合法で比較実験を行った（図2・図3）。 電気的融合法は、PEG法やHVJ-E法に比べて少量のリンパ球でも細胞融合ができ、また操作時間も短時間ですむ。 融合した細胞に与えるダメージが少ないようでハイブリドーマの成長が早い。 従って陽性ウェルのELISAスクリーニングもPEG法に比べて1日早く行うことになった。 融合の操作が簡単なため融合技術に個人差はないと考えられる。 一度、細胞融合操作及び電圧の条件等を最適化しておけば同じ動物種のリンパ球であれば、いつも同じ条件で細胞融合が行える。 一定条件で融合させれば結果にばらつきが少ない。 細胞融合も短時間で細胞に与えるダメージも少なくしかも融合効率が一番高い。 今回のラットリンパ節法のモデル実験では、PEG法に比べて約6倍の陽性ウェルが得られている。

◆まとめ

今回、3種類の細胞融合方法をマウス及びラット腸骨リンパ節細胞を用いて比較検討した。 PEG法は、経済的であるが融合ごとの差が大きい。 HVJ-E法の効率は、PEG法と同程度かそれ以上であったが融合細胞が元気に増殖すると言う点においてPEG法に比べて優れていると思われる。 電気的融合法の効率は、PEG法と比較してラットで約6倍、マウスで約3倍の高い効率であった。 効率・確実性と言う点も含め3種類の細胞融合方法の中で、明らかに電気的融合法が優れていると判断される。

重井医学研究所　免疫部門　井上聡子先生・佐渡義一先生　ご提供

ECFG21とPEG法の細胞融合効率の比較 　- 低分子抗原またはペプチド抗原 -

以下の抗原1・抗原2・抗原3は、低分子もしくはペプチドで、抗原特異的な抗体を産生する融合細胞を得るのが非常に難しい。それぞれの抗原について、リンパ球をミエローマ細胞に融合させるにあたって、ECFG21電気融合法とPEG法とを比較した。結果は、ECFG21の方が、PEG法よりも25-100倍と圧倒的に細胞融合効率が高かった。PEG法では殆ど抗体産生クローンが得られないような場合でも、ECFG21を用いればクローンを得ることができる。

Fusion/M: リンパ球1 x 10^6個辺りのハイブリドーマの数

Positive clone/M: リンパ球1 x 10^6個辺りの抗原特異的モノクローナル抗体産生クローン数

ECFG21 w/CUY497P2: ECFG21とCUY497P2電極(0.8 ml)、ECFG21 w/CUY497P8X10: ECFG21とCUY497P8X10電極(大容量 6.4 ml)

抗原1:

20 kDa immunosuppressive protein with high homolog

抗原2:

Hydrophobic octapeptide

抗原3:

Highly hydrophobic 17 amino acid peptide

文献

  • モノクロナール抗体
  • マウス骨髄腫細胞株(NS_1)
  • リンパ球

Developing inhibitory peptides against SARS-CoV-2 envelope protein

Bekdash R, Yoshida K, Nair MS, Qiu L, Ahdout J, Tsai HY, Uryu K, Soni RK, Huang Y, Ho DD, Yazawa M.

PLoS Biol. 2024 Mar 14;22(3):e3002522.

  • モノクロナール抗体
  • 脾臓

Efficient human-like antibody repertoire and hybridoma production in trans-chromosomic mice carrying megabase-sized human immunoglobulin loci

Satofuka H, Abe S, Moriwaki T, Okada A, Kazuki K, Tanaka H, Yamazaki K, Hichiwa G, Morimoto K, Takayama H, Nakayama Y, Hatano S, Yada Y, Murakami Y, Baba Y, Oshimura M, Tomizuka K, Kazuki Y.

Nat Commun. 2022 Apr 5;13(1):1841.

  • モノクロナール抗体
  • 脾臓
  • リンパ節

​Establishment of a Monoclonal Antibody against Human NTCP That Blocks Hepatitis B Virus Infection

Takemori T, Sugimoto-Ishige A, Nishitsuji H, Futamura Y, Harada M, Kimura-Someya T, Matsumoto T, Honma T, Tanaka M, Yaguchi M, Isono K, Koseki H, Osada H, Miki D, Saito T, Tanaka T, Fukami T, Goto T, Shirouzu M, Shimotohno K, Chayama K.

J Virol. 2022 Mar 9;96(5):e0168621.

  • モノクロナール抗体
  • リンパ節

An improved iliac lymph node method for production of monoclonal antibodies

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  • モノクロナール抗体
  • リンパ節

Establishment of an antibody specific for AMIGO2 improves immunohistochemical evaluation of liver metastases and clinical outcomes in patients with colorectal cancer

Goto K, Osaki M, Izutsu R, Tanaka H, Sasaki R, Tanio A, Satofuka H, Kazuki Y, Yamamoto M, Kugoh H, Ito H, Oshimura M, Fujiwara Y, Okada F.

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  • モノクロナール抗体
  • リンパ節

Establishment of a novel monoclonal antibody against truncated glycoforms of α-dystroglycan lacking matriglycans

Yamasaki F, Umezawa F, Sensui T, Anzo M, Abo H, Kuo CW, Khoo KH, Kato K, Yagi H, Kawashima H.

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  • モノクロナール抗体
  • リンパ節
  • 脾臓

The Fibronectin-ILT3 Interaction Functions as a Stromal Checkpoint that Suppresses Myeloid Cells

Paavola KJ, Roda JM, Lin VY, Chen P, O'Hollaren KP, Ventura R, Crawley SC, Li B, Chen HH, Malmersjö S, Sharkov NA, Horner G, Guo W, Kutach AK, Mondal K, Zhang Z, Lichtman JS, Song C, Rivera LB, Liu W, Luo J, Wang Y, Solloway MJ, Allan BB, Kekatpure A, Starck SR, Haldankar R, Fan B, Chu C, Tang J, Molgora M, Colonna M, Kaplan DD, Hsu JY.

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  • モノクロナール抗体
  • 脾臓

Potent mouse monoclonal antibodies that block SARS-CoV-2 infection

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J Biol Chem. 2021 Jan-Jun;296:100346.

  • モノクロナール抗体
  • リンパ球

Preferential expression of sialyl 6'-sulfo N-acetyllactosamine-capped O-glycans on high endothelial venules in human peripheral lymph nodes

Tsutsumiuchi M, Hoshino H, Kogami A, Tsutsumiuchi T, Yokoyama O, Akama TO, Kobayashi M.

Lab Invest. 2019 Oct;99(10):1428-1441.

エレクトロポレーション

ドラッグデリバリー・遺伝子導入

電気式細胞融合

蛍光組織染色・in situ HCR

細胞分離

1細胞回収・マイクロダイセクション

細胞凍結

細胞･微生物培養 (解析/計数/伸展/灌流)

In vivo 超音波イメージング

卵振動培養